產(chǎn)品貨號：M7401S，M7401M

產(chǎn)品規(guī)格：for 1×108 cells , for 5×108 cells

儲存條件：2~8℃保存，不可冷凍，有效期見外包裝

應(yīng)用范圍：分選小鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+ T細胞

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品介紹

本品是通過陰性分選法從小鼠脾臟細胞或其它組織的單細胞懸液中分離出CD4+ T細胞。原理是選用不同的生物素（biotin）標記單克隆抗體對非目標細胞（非CD4+ T細胞）進行標記，而后通過鏈霉親和素（streptavidin）標記的磁珠對非目標細胞進行清除，從而達到小鼠CD4+ T細胞分選的目的。分選過程需要用到磁力分離器。

實驗步驟

以分選小鼠脾臟CD4+ T細胞為例：

1. 制備單細胞懸液：在70μm細胞篩網(wǎng)上研磨脾臟，以預(yù)冷的PBS沖洗細胞篩網(wǎng)，收集細胞懸液于50mL離心管中，500 g，離心5 min。

2. 離心結(jié)束，棄上清，加入5mL紅細胞裂解液（ACK），室溫裂解5 min，再加入20mL PBS，500 g，離心5 min。

注意：紅細胞裂解步驟可根據(jù)所用裂解液不同調(diào)整用量及時間。少量紅細胞殘留不會影響后續(xù)分選及細胞純度。

3. 離心完成后，棄上清，將脾細胞重懸于PBS，細胞懸液用70μm細胞篩網(wǎng)過濾后，計數(shù)。計數(shù)完成后，500 g，離心5 min。

注意：細胞懸液需要過細胞篩網(wǎng)，以除去組織和細胞團塊，否則會影響后續(xù)細胞分選純度。

4. 離心完成后，棄上清，將細胞重懸于分選buffer中，調(diào)整細胞密度為1×108 cells/mL。

注意：分選buffer為含有2 mM EDTA和2%胎牛血清（FBS）的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS，需預(yù)先通過0.22μm濾膜過濾除菌。

5. 將100μL細胞懸液（1×107個細胞）加入無菌流式管底部，再加入2μLBiotin-Antibody Mix，混勻后4℃孵育10 min。

注意：加入細胞懸液時將細胞加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根據(jù)所使用磁力架不同也可使用離心管進行細胞分選。如果分選更多細胞，則按比例增加Biotin-Antibody Mix的用量。

6. 孵育完成后，在流式管中加入20μL清洗過的Streptavidin Beads（磁珠使用前需要用分選buffer進行清洗：渦旋振蕩重懸磁

珠，吸取實驗需要的磁珠至1.5mL 離心管，加入1mL分選buffer，10000 g離心1 min，棄上清。加入1mL分選buffer重復(fù)洗滌磁珠1次后用與原來相同體積的分選buffer重懸磁珠。如吸取20μL磁珠進行清洗，則清洗后用20μL分選buffer進行重懸），混勻后4℃孵育10 min。

注意：如果分選更多細胞，則按比例增加Streptavidin Beads用量。例如分選5×107個細胞，在500μL細胞懸液中加入10 μL Biotin-Antibody Mix和100μL Streptavidin Beads。如果分選少于1×107個細胞，則將細胞懸液體積補至100μL，加入2μLBiotin-Antibody Mix和20μLStreptavidin Beads。

7. 孵育完成后，在流式管中加入2.5mL分選buffer，用移液器上下混合吹打5次混勻（避免劇烈振蕩或者上下顛倒混勻）。

8. 將含有細胞的分選流式管置于磁力架上，靜置5 min。

9. 將細胞懸液輕柔倒入一個無菌離心管中（傾倒過程中流式管不要脫離磁力架），此細胞懸液中即包含純化的小鼠CD4+ T細胞，500 g，離心5 min。離心后棄上清，收集細胞。

10. 根據(jù)實驗需要洗滌細胞后，將細胞重懸于所需緩沖液或培養(yǎng)基中，即可用于后續(xù)分子生物學(xué)或細胞生物學(xué)實驗。

圖1.本產(chǎn)品分選效果圖

從C57BL/6小鼠脾臟細胞中分選CD4+ T細胞，分選前后的細胞用FITC anti-mouse CD4抗體（克隆號GK1.5）標記后進行流式細胞儀分析，分選前后的CD4+ T細胞純度分別為20.3%和98.8%。

注意事項

1. 磁珠和抗體混合液使用和保存過程中均應(yīng)避免冷凍、高速離心等操作；

2. 建議選用低吸附移液器吸頭和離心管，避免因吸附造成磁珠和抗體的損耗；

3. 本產(chǎn)品需與磁性分離器配套使用；

4. 本產(chǎn)品僅供研究使用。