產(chǎn)品貨號：

產(chǎn)品規(guī)格：

儲存條件：-20℃保存，組分A需避光，避免反復(fù)凍融。有效期見外包裝。冰袋運(yùn)輸。

應(yīng)用范圍：細(xì)胞凋亡檢測。

產(chǎn)品介紹

細(xì)胞發(fā)生凋亡時, 會激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時會出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與YF^® -dUTP結(jié)合，從而通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對完整的單個凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中廣泛采用。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測。

注意事項(xiàng)

1. 使用前請將產(chǎn)品瞬時離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當(dāng)減少染色時間。

3. 實(shí)驗(yàn)時建議增加陰性對照和陽性對照組。

4. 組分A使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

5. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

7. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

1. 為什么出現(xiàn)了一些非特異標(biāo)記？

1)有些細(xì)胞，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導(dǎo)致假陽性。建議:取出細(xì)胞后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時設(shè)置陰性對照。
2) 固定液濃度過高或過低，導(dǎo)致中心部分細(xì)胞固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽性。建議:推薦使用4%多聚甲醛。
3) TdT 酶反應(yīng)時間過長或Tunel反應(yīng)過程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞表面不能保持濕潤。注意控制反應(yīng)時間，并確保TdT 酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
4) 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。

2. 為什么沒有染上熒光？

1) 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率。
2) 細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，不同的細(xì)胞所需要的通透時間略有不同，適當(dāng)調(diào)整。
3) 延長標(biāo)記時間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量。
4) 確定實(shí)驗(yàn)對象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽性對照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。

3 如何對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染？

可在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后對細(xì)胞核進(jìn)行染色。

4. 為什么熒光背景高？

1) 支原體污染：可以使用支原體染色檢測試劑盒驗(yàn)證。
2) TdT 酶反應(yīng)時間過長，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說明書操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用。
3) 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時也會出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測；
4) 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時要避開自發(fā)熒光的顏色。
5) DAB 孵育時間過長，減少DAB 染色時間。
6) Biotin-X-dUTP 的非特異性結(jié)合，在TdT 酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

5. 標(biāo)記率低？

1) 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購買的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2) 固定時間過長，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高，減少固定時間。
3) 貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，可以對多孔板進(jìn)行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機(jī)，請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時被洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。