產(chǎn)品貨號(hào)：

產(chǎn)品規(guī)格：

儲(chǔ)存條件：-20℃保存，組分A需避光，避免反復(fù)凍融。有效期見(jiàn)外包裝。冰袋運(yùn)輸。

應(yīng)用范圍：細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

產(chǎn)品介紹

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí), 會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180 bp-200 bp的 DNA 片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜?；蚪MDNA雙鏈或單鏈斷裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與YF^® -dUTP結(jié)合，從而通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中廣泛采用。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測(cè)冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測(cè)培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況?？蛇x擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，耗時(shí)短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2. 染色背景較重或非特異性著色明顯時(shí)可適當(dāng)減少染色時(shí)間。

3. 實(shí)驗(yàn)時(shí)建議增加陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組。

4. 組分A使用時(shí)請(qǐng)佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請(qǐng)立即用大量水沖洗。

5. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

6. 本產(chǎn)品僅限于科研，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

7. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

1. 有些細(xì)胞或組織，比如平滑肌核酸酶或聚合酶活性水平較高，使得DNA全部被切斷，易導(dǎo)致假陽(yáng)性。建議：取出細(xì)胞或組織后要立即固定并充分固定，以阻止這些酶的活性，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。
2. 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶影響，建議：對(duì)于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，適當(dāng)延長(zhǎng)封閉時(shí)間和升高過(guò)氧化氫的濃度。
3. 固定液濃度過(guò)高或過(guò)低，導(dǎo)致組織中心部分固定效果不佳，而使得中心部細(xì)胞自溶、DNA鏈出現(xiàn)不規(guī)則斷裂，產(chǎn)生假陽(yáng)性。建議：推薦使用4%多聚甲醛。
4. TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或Tunel反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)液發(fā)生蒸發(fā)或滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TdT 酶反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
5. 石蠟、脂肪、血液、體液等都較易與染料結(jié)合，所以組織切片制作時(shí)要保持干凈、脫蠟要徹底。
6. 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開(kāi)自發(fā)熒光的顏色。

◆為什么沒(méi)有染上熒光？
1. 固定不充分。固定液首選4%多聚甲醛，現(xiàn)用現(xiàn)配。不建議使用乙醇，乙醇固定液對(duì)組織的滲透力較弱，影響TUNEL標(biāo)記效率.
2. 細(xì)胞膜和核膜的通透不充分，TdT酶未能到達(dá)核內(nèi)。細(xì)胞與冰凍切片，可用0.2% Triton X-100溶液通透5-30min，石蠟切片推薦使用蛋白酶K，37℃通透30 min；不同的細(xì)胞和組織所需要的通透時(shí)間略有不同，時(shí)間太長(zhǎng)容易脫片，適當(dāng)調(diào)整。
3. 延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間至2h，并適當(dāng)增加TdT酶及dUTP的用量。
4. 確定實(shí)驗(yàn)對(duì)象細(xì)胞有凋亡。準(zhǔn)備一份DNase I處理的陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證TdT酶反應(yīng)是否正確進(jìn)行。

◆如何對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染？
可在TUNEL反應(yīng)結(jié)束后對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。

◆為什么熒光背景高？
1. 支原體污染：可以使用支原體染色檢測(cè)試劑盒驗(yàn)證。
2. TdT 酶反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液將TdT酶稀釋2-5倍后再按照說(shuō)明書(shū)操作，稀釋后的TdT酶僅供當(dāng)日使用。
3. 處于高速分裂和增殖狀態(tài)中的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA 斷裂。建議：在非高增殖期取樣檢測(cè)；
4. 有些試劑或細(xì)胞存在自發(fā)熒光，選擇染料時(shí)要避開(kāi)自發(fā)熒光的顏色。
5. DAB 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，減少DAB 染色時(shí)間。
6. Biotin-X-dUTP 的非特異性結(jié)合，在TdT 酶反應(yīng)之后，再用含0.1% Triton X-100 和1 mg/ml BSA 的PBS 洗三次。

◆標(biāo)記率低？
1. 乙醇、甲醇或甲醛（市面上購(gòu)買(mǎi)的甲醛大多含有甲醇）固定的樣品標(biāo)記效率較低（因?yàn)樵诠潭〞r(shí)染色質(zhì)未能與蛋白質(zhì)交聯(lián)，而在操作中丟失），采用推薦的固定液。
2. 固定時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過(guò)高，減少固定時(shí)間。
3. 貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會(huì)細(xì)胞皺縮，貼壁黏附力降低，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞容易脫落。建議：在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，可以對(duì)多孔板進(jìn)行1000g離心5min，然后再吸出培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒(méi)有適合的離心機(jī)，請(qǐng)注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)被洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。

◆在蛋白酶K中消化組織樣品多久？
大部分組織樣品需要充分消化15分鐘。最佳的培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)組織類型和厚度而不同。腦組織比其他組織需要更長(zhǎng)的蛋白酶處理時(shí)間。 

◆實(shí)驗(yàn)的組織切片應(yīng)該多厚？
老鼠腸、腎臟、肝臟、心臟和結(jié)腸厚度5–20 μm。