產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品內(nèi)容
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規(guī)格 組分 |
Y6002S（10T） |
Y6002M（50T） |
Y6002L（100T） |
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A. 1× Annexin V 結(jié)合緩沖液 |
10 mL |
50 mL |
50 mL×2 |
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B. YF®488-Annexin V |
50 μL |
250 μL |
500 μL |
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C. PI |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
儲(chǔ)存條件
4℃避光冷藏，請(qǐng)勿凍存。有效期見外包裝。
光譜特性
YF®488-Annexin V: Ex/Em = 490/515 nm
PI: Ex/Em = 535/617 nm (with DNA)
產(chǎn)品介紹
Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36KD的 Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可于磷脂酰絲氨酸（PS）選擇性結(jié)合。磷脂酰絲氨酸（PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。此時(shí)，使用綠色熒光探針 YF®488 標(biāo)記的 Annexin V，即 YF®488-Annexin V，與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，就可用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡直接檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。對(duì)于壞死或晚期凋亡的細(xì)胞，由于細(xì)胞完整性已經(jīng)被破壞，YF®488-Annexin V則可以進(jìn)入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側(cè)的 PS 結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。PI可以由488，532或546 nm的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。
注意事項(xiàng)
1.使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2.為降低細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長(zhǎng)至30 min。
3.由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過程，建議樣品在染色后 1 h之內(nèi)進(jìn)行分析。
4.對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI 攝入過多；消化時(shí)間過長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與 YF®488-Annexin V的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會(huì)影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合。
5.貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，建議在最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30 min后染色，避免假陽(yáng)性。
6.為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。
7. 染料的最佳使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。
8. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
9. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
客戶使用反饋：
常見問題解答：
◆為何染色結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率過高？
1. 凋亡時(shí)間處理過長(zhǎng)，使細(xì)胞全部死亡。建議重新摸索細(xì)胞凋亡條件，使細(xì)胞處于不同的凋亡狀態(tài)。
2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化時(shí)間過長(zhǎng)或機(jī)械刮擦細(xì)胞會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜，使Annexin V能夠與細(xì)胞膜胞內(nèi)面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。建議在胰蛋白酶消化或機(jī)械刮擦細(xì)胞后，讓細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30分鐘，以恢復(fù)其膜完整性。
◆實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用什么儀器觀察？
實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，但更推薦使用流式細(xì)胞儀。因?yàn)檎５募?xì)胞和凋亡的細(xì)胞膜上都有磷脂酰絲氨酸（PS），只是凋亡細(xì)胞膜外更多，可以結(jié)合更多的Annexin V，流式細(xì)胞儀更靈敏，可以區(qū)分出微小差異，將正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞分成不同的兩群，但如果用熒光顯微鏡，可能觀察不到這一差別，尤其是貼壁細(xì)胞。若要在成像測(cè)定中檢測(cè)細(xì)胞凋亡，推薦使用SuperView? 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。
◆流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果圖中的各個(gè)象限代表什么狀態(tài)的細(xì)胞？
左上角：Annexin V-/PI+，機(jī)械損傷細(xì)胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡細(xì)胞或壞死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡細(xì)胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常細(xì)胞。
◆這款試劑盒可同時(shí)檢測(cè)出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)出來的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時(shí)，凋亡檢測(cè)與周期檢測(cè)時(shí)PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 如果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆各象限代表的細(xì)胞狀態(tài)問題？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。
1. 消化液中含有EDTA或消化時(shí)間過長(zhǎng)引起的假陽(yáng)性。Annexin V和PS的結(jié)合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會(huì)造成假陰性。其次消化時(shí)間不宜過長(zhǎng)，吹打細(xì)胞要輕柔，因?yàn)橐让傅倪^度消化和機(jī)械損傷都會(huì)引起細(xì)胞膜的損傷，造成假陽(yáng)性。細(xì)胞消化下來后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育30min，使細(xì)胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽(yáng)性，或者將細(xì)胞報(bào)訊在含2% BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。
2. 如果樣品來源于血液，必須去除血液中的血小板，因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議：可以含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板， 最后細(xì)胞多洗幾遍，減小EDTA螯合鈣離子產(chǎn)生的影響。
3. 神經(jīng)細(xì)胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡不適用于神經(jīng)細(xì)胞。
4. 誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)。一般情況下誘導(dǎo)幾個(gè)小時(shí)就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時(shí)以上，誘導(dǎo)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差，假陽(yáng)性結(jié)果偏高。
◆熒光染料選擇的問題？
1. 實(shí)驗(yàn)樣本是否帶熒光，因?yàn)楦腥静《净蛸|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往帶GFP熒光，GFP與YF488/FITC通道重疊，不能選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V，此時(shí)如果只有488 nm一根激光管可以用PE標(biāo)記Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式細(xì)胞儀帶有488 nm和633 nm兩個(gè)或以上激光管，首先考慮用APC或YF647標(biāo)記 Annexin V，因?yàn)樗蚉I通道幾乎不用考慮光重疊問題，可以減少調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒?，如果只?88 nm激光管則可選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V。
3. 處理因素是否帶有熒光，本實(shí)驗(yàn)室就碰到過一個(gè)促凋亡藥物Doxorubicin本身發(fā)紅色熒光，對(duì)PI通道的檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時(shí)建議選用A6079或Y6102 。
◆ 圈門問題？
1.要特別注意在FSC/SSC圈門時(shí)，所選細(xì)胞范圍會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大影響，所以在分析數(shù)據(jù)時(shí)，要把所有細(xì)胞都圈進(jìn)FSC/SSC的門內(nèi)，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會(huì)更可信。如圖，使細(xì)胞群大概位于對(duì)角線上，并且細(xì)胞群較集中，群內(nèi)細(xì)胞比例要在80%以上，如果細(xì)胞全部圈入，細(xì)胞比例才50%或者更低，說明細(xì)胞被壓在了坐標(biāo)軸上，這時(shí)要重新調(diào)節(jié)FSC和SSC。
2.貼壁細(xì)胞做Annexin V凋亡檢測(cè)，通常分群不太規(guī)則，這時(shí)我們可以根據(jù)不加藥細(xì)胞來畫不規(guī)則的十字門。如上面圖形的設(shè)門方式：
◆免疫染色與凋亡染色順序問題?
Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？
可以，但建議Annexin V和其它抗體分開染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時(shí)標(biāo)記淋巴細(xì)胞，可以先在PBS中標(biāo)記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標(biāo)記Annexin V。
◆這款試劑盒可同時(shí)檢測(cè)出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)出來的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時(shí)，凋亡檢測(cè)與周期檢測(cè)時(shí)PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 若果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆固定、冷凍、切片或解離的組織，還可以做流式細(xì)胞分析嗎？
不建議做流式細(xì)胞分析。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個(gè)，活性好，這些狀態(tài)下的樣本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影響，因此無(wú)法依賴膜的完整性區(qū)分健康細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。組織在凍存、復(fù)溫的過程中會(huì)有大量的細(xì)胞死亡，同時(shí)經(jīng)過這一過程的組織在分離成單個(gè)細(xì)胞的時(shí)候會(huì)形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測(cè)，所以用于流式檢測(cè)的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測(cè)，效果最好。 液氮保存的◆組織塊，可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。
◆Annexin V可以用在植物和細(xì)菌中嗎？
Annexin V也可以用在植物和細(xì)菌中檢測(cè)凋亡，具體實(shí)驗(yàn)步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)。
使用本產(chǎn)品的文獻(xiàn)：
1.Iron Accumulation Leads to Bone Loss by Inducing Mesenchymal Stem Cell Apoptosis Through the Activation of Caspase3
Ye YuanFei XuYan CaoLi XuChen YuFan YangPeng ZhangLiang WangGuangsi ShenJianrong WangYoujia Xu
Biological Trace Element Research(2018) 434–441
應(yīng)用方向：流式細(xì)胞儀檢測(cè)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的凋亡
2.鐵蓄積誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡并抑制成骨活性的研究
袁曄, 張鵬王亮, 徐非, 俞晨, 楊帆, 張輝, 易劍橋, 徐又佳
中華實(shí)驗(yàn)外科雜志 (2017) 1839-1842
應(yīng)用方向：流式細(xì)胞儀檢測(cè)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的凋亡
3.Near-infrared upconversion–activated CRISPR-Cas9 system: A remote-controlled gene editing platform
Yongchun Pan, Jingjing Yang, Xiaowei Luan, Xinli Liu, XUEqing Li, Jian Yang, Ting Huang, Lu Sun, Yuzhen Wang.
Science Advances(2019)
應(yīng)用方向：流式細(xì)胞儀檢測(cè)：A549細(xì)胞的凋亡
4.外泌體介導(dǎo)乳腺癌 MCF-7 細(xì)胞對(duì)多柔比星耐藥性的機(jī)制
張如月； 李朵璐； 楊哲； 郭金秀； 周玉冰
藥學(xué)學(xué)報(bào)(2019)
應(yīng)用方向：熒光顯微鏡凋亡檢測(cè)：MCF-7、MCF-7/Exo、MCF-7/Dox細(xì)胞的凋亡
5.MS-275聯(lián)合順鉑對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌9706細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響
劉騰飛,王亞蘋,李亞,張振坤,李喆,周馨魁,張璐玉,王文杰,劉紅濤,張彥婷,關(guān)方霞,馬珊珊
鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
應(yīng)用方向：流式細(xì)胞儀檢測(cè)：食管鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌) EC9706細(xì)胞的凋亡
6.MS-275 combined with cisplatin exerts synergistic antitumor effects in human esophageal squamous cell carcinoma cells
Tengfei Liu，F(xiàn)angxia Guan，Yaping Wang，Zhenkun Zhang，Ya Li，Yuanbo Cui，Zhe Li，Hongtao Liu，Yanting Zhang，Yuming Wang，Shanshan Ma
Toxicology and Applied Pharmacology Volume 395, 15 May 2020, 114971
7.Deformable liposomal codelivery of vorinostat and simvastatin promotes antitumor responses through remodeling tumor microenvironment
Bin Tu,Yang He,Binfan Chen,Yonghui Wang,Yanrong Gao,Mingjie Shi,Tuanbing Liu,Akmal M. Asrorov，Yongzhuo Huang
Biomaterials Science
8.Effective Genome Editing Using CRISPR-Cas9 Nanoflowers
Chen Zhang , He Ren , Gengqi Liu , Jiexin Li , Xiaojie Wang , Yumiao Zhang
Advanced Healthcare
Materials
微信服務(wù)號(hào)