產(chǎn)品概述：
產(chǎn)品內(nèi)容
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組分 |
Y6102S (10T) |
Y6102M（50T） |
Y6102L (100T) |
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A. 1× Annexin V 結(jié)合緩沖液 |
10 mL |
50 mL |
50 mL×2 |
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B. YF®488-Annexin V |
50 μL |
250 μL |
500 μL |
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C. RedNucleus II |
100 μL |
500 μL |
1 mL |
儲(chǔ)存條件
4℃避光冷藏，請(qǐng)勿凍存。有效期見(jiàn)外包裝。
光譜特性
YF®488-Annexin V：Ex/Em=490/515 nm
RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm
產(chǎn)品介紹
Annexin V（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為 35-36 KD的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，可與磷脂酰絲氨酸（PS）選擇性結(jié)合。磷脂酰絲氨酸（PS）主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。此時(shí)，使用綠色熒光探針 YF®488的 Annexin V, 即 YF®488-Annexin V，與外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）結(jié)合，就可用流式細(xì)胞儀直接檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。正常細(xì)胞不會(huì)被 YF®488-Annexin V所染色，發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞會(huì)被 YF®488-Annexin V 所染色。YF®488-Annexin V可以與部分非滲透性的細(xì)胞核染料（7-AAD/PI）等聯(lián)合使用，區(qū)分處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞。
本試劑盒中提供的 RedNucleus II 是一種遠(yuǎn)紅光染料，屬于蒽醌類化合物，不能透過(guò)活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，是非滲透性的，但是可以快速染色死亡和透化細(xì)胞中的細(xì)胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一種理想的碘化丙啶（PI）和 7-AAD 的替代物。YF®488 與 RedNucleus II 之間光譜無(wú)交叉。與 YF®488-Annexin V 聯(lián)用，對(duì)于無(wú)自發(fā)熒光、自帶 RFP 或阿霉素誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞，都無(wú)需補(bǔ)償調(diào)節(jié)。
注意事項(xiàng)
1. 使用前請(qǐng)將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2. 為降低細(xì)胞凋亡進(jìn)程，孵育過(guò)程可在冰上操作，但孵育時(shí)間至少延長(zhǎng)至30 min。
3. 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后 1 h之內(nèi)進(jìn)行分析。
4. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，RedNucleus II 攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與 YF®488-Annexin V的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用 EDTA，EDTA 會(huì)影響 Annexin V 與 PS 的結(jié)合。
5. 貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，建議在最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30 min后染色，避免假陽(yáng)性。
6. 為了避免洗滌細(xì)胞時(shí)損失細(xì)胞，在吸液時(shí)可以用大的 Tip 頭套上小的 Tip 頭吸液。
7. 染料的最佳使用濃度由具體實(shí)驗(yàn)要求確定。
8. 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，保存和使用過(guò)程中請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
9. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
常見(jiàn)問(wèn)題解答：
◆為何染色結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率過(guò)高？
1. 凋亡時(shí)間處理過(guò)長(zhǎng)，使細(xì)胞全部死亡。建議重新摸索細(xì)胞凋亡條件，使細(xì)胞處于不同的凋亡狀態(tài)。
2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰蛋白酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或機(jī)械刮擦細(xì)胞會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜，使Annexin V能夠與細(xì)胞膜胞內(nèi)面上的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。建議在胰蛋白酶消化或機(jī)械刮擦細(xì)胞后，讓細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中培養(yǎng)約30分鐘，以恢復(fù)其膜完整性。
◆實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用什么儀器觀察？
實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以通過(guò)流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，但更推薦使用流式細(xì)胞儀。因?yàn)檎５募?xì)胞和凋亡的細(xì)胞膜上都有磷脂酰絲氨酸（PS），只是凋亡細(xì)胞膜外更多，可以結(jié)合更多的Annexin V，流式細(xì)胞儀更靈敏，可以區(qū)分出微小差異，將正常細(xì)胞與凋亡細(xì)胞分成不同的兩群，但如果用熒光顯微鏡，可能觀察不到這一差別，尤其是貼壁細(xì)胞。若要在成像測(cè)定中檢測(cè)細(xì)胞凋亡，推薦使用SuperView? 488 Caspase-3 Assay Kit for Live Cells。
◆流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果圖中的各個(gè)象限代表什么狀態(tài)的細(xì)胞？
左上角：Annexin V-/PI+，機(jī)械損傷細(xì)胞；右上角: AnnexinV+/PI+，晚期凋亡細(xì)胞或壞死；右下角：AnnexinV+/PI-，早期凋亡細(xì)胞；左下角：AnnexinV-/PI-，正常細(xì)胞。
◆這款試劑盒可同時(shí)檢測(cè)出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)出來(lái)的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時(shí)，凋亡檢測(cè)與周期檢測(cè)時(shí)PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 如果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆各象限代表的細(xì)胞狀態(tài)問(wèn)題？
Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。
Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死。
Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。
Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。
◆假陽(yáng)性問(wèn)題？
1. 消化液中含有EDTA或消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)引起的假陽(yáng)性。Annexin V和PS的結(jié)合需要Ca2+，而EDTA是Ca2+螯合劑，使用含有EDTA的胰酶會(huì)造成假陰性。其次消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，吹打細(xì)胞要輕柔，因?yàn)橐让傅倪^(guò)度消化和機(jī)械損傷都會(huì)引起細(xì)胞膜的損傷，造成假陽(yáng)性。細(xì)胞消化下來(lái)后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育30min，使細(xì)胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽(yáng)性，或者將細(xì)胞報(bào)訊在含2% BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。2. 如果樣品來(lái)源于血液，必須去除血液中的血小板，因?yàn)檠“搴蠵S，能與Annexin V結(jié)合，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議：可以含有EDTA的緩沖液200g離心去除血小板， 最后細(xì)胞多洗幾遍，減小EDTA螯合鈣離子產(chǎn)生的影響。
3. 神經(jīng)細(xì)胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡不適用于神經(jīng)細(xì)胞。
4. 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。一般情況下誘導(dǎo)幾個(gè)小時(shí)就可以出現(xiàn)早期凋亡，因此通常不需要處理大于48小時(shí)以上，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)耗盡，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)差，假陽(yáng)性結(jié)果偏高。
◆熒光染料選擇的問(wèn)題？
1. 實(shí)驗(yàn)樣本是否帶熒光，因?yàn)楦腥静《净蛸|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往帶GFP熒光，GFP與YF488/FITC通道重疊，不能選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V，此時(shí)如果只有488 nm一根激光管可以用PE標(biāo)記Annexin V，用7-AAD代替PI，若有633 nm激光管，可以改用YF647 Annexin V代替YF488。
2. 如果流式細(xì)胞儀帶有488 nm和633 nm兩個(gè)或以上激光管，首先考慮用APC或YF647標(biāo)記 Annexin V，因?yàn)樗蚉I通道幾乎不用考慮光重疊問(wèn)題，可以減少調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒?，如果只?88 nm激光管則可選擇YF488/FITC標(biāo)記的Annexin V。
3. 處理因素是否帶有熒光，本實(shí)驗(yàn)室就碰到過(guò)一個(gè)促凋亡藥物Doxorubicin本身發(fā)紅色熒光，對(duì)PI通道的檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時(shí)建議選用A6079或Y6102 。
◆圈門問(wèn)題？
1.要特別注意在FSC/SSC圈門時(shí)，所選細(xì)胞范圍會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大影響，所以在分析數(shù)據(jù)時(shí)，要把所有細(xì)胞都圈進(jìn)FSC/SSC的門內(nèi)，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會(huì)更可信。如圖，使細(xì)胞群大概位于對(duì)角線上，并且細(xì)胞群較集中，群內(nèi)細(xì)胞比例要在80%以上，如果細(xì)胞全部圈入，細(xì)胞比例才50%或者更低，說(shuō)明細(xì)胞被壓在了坐標(biāo)軸上，這時(shí)要重新調(diào)節(jié)FSC和SSC。
2.貼壁細(xì)胞做Annexin V凋亡檢測(cè)，通常分群不太規(guī)則，這時(shí)我們可以根據(jù)不加藥細(xì)胞來(lái)畫(huà)不規(guī)則的十字門。如上面圖形的設(shè)門方式：
◆免疫染色與凋亡染色順序問(wèn)題?
Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？
可以，但建議Annexin V和其它抗體分開(kāi)染色。例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時(shí)標(biāo)記淋巴細(xì)胞，可以先在PBS中標(biāo)記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標(biāo)記Annexin V。
◆這款試劑盒可同時(shí)檢測(cè)出凋亡率和細(xì)胞周期分布嗎？
不可以。檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)PI結(jié)合的是核酸，包括DNA和RNA。而PI用于檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)需要只結(jié)合DNA，由于RNA的干擾，用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)出來(lái)的細(xì)胞周期不準(zhǔn)。同時(shí)，凋亡檢測(cè)與周期檢測(cè)時(shí)PI的工作濃度以及樣本處理都不一樣。 若果需要進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，推薦Cell Cycle and Apoptosis Kit（C6031）
◆固定、冷凍、切片或解離的組織，還可以做流式細(xì)胞分析嗎？
不建議做流式細(xì)胞分析。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個(gè)，活性好，這些狀態(tài)下的樣本外膜上的PS及膜的完整性都受到了影響，因此無(wú)法依賴膜的完整性區(qū)分健康細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。組織在凍存、復(fù)溫的過(guò)程中會(huì)有大量的細(xì)胞死亡，同時(shí)經(jīng)過(guò)這一過(guò)程的組織在分離成單個(gè)細(xì)胞的時(shí)候會(huì)形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測(cè)，所以用于流式檢測(cè)的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測(cè)，效果最好。 液氮保存的◆組織塊，可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。
◆Annexin V可以用在植物和細(xì)菌中嗎？
Annexin V也可以用在植物和細(xì)菌中檢測(cè)凋亡，具體實(shí)驗(yàn)步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)。
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